Kryobióza - skrytý život
9. 3. 2012
Život je většinou spojen s dějem. Živé objekty se od neživých liší pochody, jako jsou výměna energie, látková přeměna, růst, vývoj a rozmnožování. Smrt potom chápeme jako nevratné zastavení všech těchto životních funkcí. Setkáváme se však také s organizmy, u nichž je zastavení životních dějů vratné; jejich život se dočasně omezuje na pouhou životaschopnou strukturu. Zdá se tedy, že život není přítomen, ale o smrti také nelze mluvit, jelikož návrat k životu je možný. Mluvíme o kryptobióze, skrytém životě.
V přírodě existují tři základní příčiny vstupu do skrytého života. Je to nedostatek vody, nízká teplota a nedostatek energie. My se budeme zabývat především kryobiózou, tedy “přežitím” v extrémně nízkých teplotách.
Doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc., fyziolog hmyzu, Biologické centrum AV ČR: Kryobióza je jeden z kryptobiotických stavů, kdy ten organizmus upadá do absolutní strnulosti, během níž nedokážeme naměřit žádnou metabolickou aktivitu. Nedokážeme vůbec zjistit žádné životní projevy u toho živočicha.
Tvor se navenek neprojevuje jako živý, nýbrž jako mrtvý. Přesto se jeho struktura zachovala v životaschopném stavu. Po odeznění podmínek, které navodily kryobiózu, je možné tvora oživit. Vědci z Biologického ústavu v Českých Budějovicích se zabývají tím, jak může hmyz přežít za teplot hluboko pod nulou, třeba v extrémních podmínkách kapalného dusíku.
Doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc., fyziolog hmyzu, Biologické centrum AV ČR: Fascinuje nás to tím, že můžeme uvažovat i o takových otázkách, jako je cestování prostorem v tom kryobiotickém stavu, to znamená cestování otevřeným vesmírem, nebo přežití po velmi dlouhé časové období, přežití navěky v podstatě, na věčnost.
Klesá-li teplota, zpomaluje se pohyb částic a s ním i všechny biofyzikální děje. Je tedy možné, aby se při určité teplotě život zcela zastavil? Jistěže ano. Je však možné, aby po zvýšení teploty život opět pokračoval? Podobnou otázku si klade teoretická kryobiologie. Praktická kryogenika potom navazuje vývojem technologií pro skladování biologického materiálu za nízkých teplot. Kromě toho existuje také kryonika, která se zabývá ukládáním mrtvých lidských těl do kapalného dusíku. Proto ji skeptičtější vědci považují spíše za způsob pohřbívání, než za vědu.
Prof. MUDr. Václav Mandys, CSc., přednosta Ústavu patologie 3. LF UK: Lidé by spíš měli být přesvědčováni k tomu, že pokud si chtějí zachovat nesmrtelnost, tak si jí mají zachovat tím, že předají svoji genetickou informaci dál a ne tím, že zůstanou oni sami jako jedinci zachováni, to je proti přírodním zákonům. Nedá se nic dělat, ale je to tak.
Změna teploty se dotkne každé biologické struktury a každého pochodu. Bílkoviny nezbytné pro organizmus se rozdělí na části již za teplot kolem nula stupňů Celsia. Nižší teploty mohou způsobit nevratnou denaturaci, sražení, neboli přechod do nefunkčního prostorového uspořádání. Pokles teploty mění i vlastnosti buněčných struktur. Voda krystalizuje na led, a právě tyto krystalky ledu působí rozsáhlé zničení zmrazených organismů.
Doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc., fyziolog hmyzu, Biologické centrum AV ČR: Jenom velmi malá skupinka obratlovců dokáže přežít za tělních teplot pod nulou a většina z nich se rekrutuje z říše tak zvaných studenokrevných obratlovců. To znamená, jsou to žáby, jeden druh plaza, mloci. Můžeme je spočítat na prstech jedné nebo dvou rukou. Takovým rekordmanem z tohoto pohledu je skokan hnědý, který přežívá tělní teploty až kolem minus šest stupňů Celsia a v té chvíli až 65 procent jeho tělní vody může být přeměněno na led.
Skokan lesní obývá sever Ameriky až po polární kruh. Klíčem k přežití skokanů je zabránit tvorbě ledových krystalů v buňkách. Rostoucí krystal by se tam totiž choval doslova jako slon v porcelánu. Pokud led vzniká za vyšší teploty, soustředí se nejprve pod povrchem kůže, v břišní dutině, močovém měchýři a ve střevě. Krystalky ledu postupně rostou a mimobuněčný roztok se koncentruje. Díky rozdílům tlaků se voda z buněk odsává.
Vodné roztoky v buňkách i krev se zahušťují, a tím zůstávají odolné proti zamrznutí. Velmi pomalé ochlazování dává čas na přípravu k další fázi promrznutí. Při dalším poklesu teplot nakonec promrzá i krev, nervová a svalová aktivita ustává, krevní oběh se zastaví. Ani tehdy se však nejedná o skrytý život, jelikož v zahuštěném, ale stále tekutém prostředí uvnitř buněk dál pomalu pokračují životní procesy. Skutečné kryobionty živočišné říše proto hledejme mezi hmyzem.
Doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc., fyziolog hmyzu, Biologické centrum AV ČR: Ta hmyzí výjimečná schopnost přežití za velmi nízkých podnulových teplot je dána podle naší představy celým složitým komplexním systémem nejrůznějších adaptací, které začínají od genů, jdou přes fyziologické a biochemické mechanismy, přes buněčnou úroveň až po chování a morfologii toho jedince.
Největším problémem je vypořádat se s destruktivní tvorbou ledu. Existují dvě možnosti a hmyz využívá obě. Buď je možné oddálit tvorbu ledu a udržet vodu v kapalném podchlazeném stavu, nebo tolerovat promrznutí, či jej dokonce řízeně zahájit. První strategie je pravděpodobně rozšířenější. U takových druhů hmyzu běžně pozorujeme sezonní pokles bodu podchlazení až na minus 60 °C. Metabolismus tohoto hmyzu produkuje ohromující množství látek chránících proti mrazu. To působí stejně jako nemrznoucí směs, kterou motorista přidává na zimu do auta. Druhou strategií je tolerance promrznutí. Některé druhy hmyzu ji dovedly k dokonalosti, tedy ke schopnosti úplného skrytého života při minus196 °C. Důležité je zmrznout včas a pomalu.
Doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc., fyziolog hmyzu, Biologické centrum AV ČR: V tomto ohledu zcela nejunikátnějším příkladem je subarktická muška Chymomysa costata. Je to tedy muška z čeledi octomilkovitých, ovšem vyskytuje se v subarktické nebo temperátní mírné oblasti a její larvy přezimují ve stadiu diapauzy a v tomto stádiu jsou schopny tolerovat promrznutí tělních tekutin a dokonce v laboratoři je můžeme zchladit až na teplotu kapalného dusíku.
A larvy to přežijí! Naplňují tak kryogenický sen. Přestože mají plně vyvinuté orgány, dokáží je postupně zchladit, i když obsahují vodu. Podmínkou jejich úspěšného zmrazení je předchozí pomalé přivykání na nízké teploty, během něhož se mění struktura buněčných membrán a hromadí se látky zabraňující tvorbě ledu. Vědcům z Biologického ústavu v Českých Budějovicích se podařilo v poslední době získat docela zajímavé výsledky. Jejich práce poodhaluje složité mechanizmy hmyzí mrazuvzdornosti.
Doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc., fyziolog hmyzu, Biologické centrum AV ČR: Náš výzkum je zaměřen k tomu, abychom pochopili, které fyziologické a biochemické mechanismy mu tuto výjimečnou schopnost zajišťují. My jsme se snažili najít nějaký algoritmus, to znamená stlačit tu komplexitu této adaptace na takovou úroveň, aby byla přenositelná i na nějaký jiný druh, který evolučně tyto vlastnosti nezískal, to znamená nějaký k chladu citlivý druh.
Vědci zjistili, že celý složitý pochod mohou nakonec zúžit na dva základní mechanismy. Ty je možné vyjádřit dvěma slovy: diapauza a kryoprezervace. Diapauza je stav, ve kterém hmyz dokáže pozastavit vývoj nebo růst a silně oslabit metabolismus, aby přečkal nepříznivé období. Kryoprezervace znamená zachování struktur organismu za nízkých teplot. Vědci přitom odhalili, že přímý vliv tu má volná aminokyselina zvaná prolin. Tu si muška vyrábí sama právě ve stádiu diapauzy.
Vědci pak v laboratorních podmínkách zvyšovali hladinu prolinu i pomocí potravy. Zjistili, že pokud se zvyšuje koncentrace prolinu ve tkáních larev, výrazně se i zvýší jejich tolerance k promrznutí až k teplotám kapalného dusíku. Analýzy naznačily, že vysoká hladina prolinu – spolu s dalšími okolnostmi – zvyšují přechod tělních tekutin do nekrystalické fáze. Tím se omezí poškození způsobená extrémně nízkými teplotami. Důležitým krokem je také zajistit tvorbu okolních ledových krystalů již při relativně vysokých teplotách blízkých nule.
Doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc., fyziolog hmyzu, Biologické centrum AV ČR: Toho my docilujeme jednoduchým trikem, a to tak že larvu obalíme buničitou vatou, která je nasáklá vodou a tu vodu promrazíme tím, že přidáme malý ledový krystalek. Ten ledový krystalek se chová jako nukleátor a při teplotách blízkých nule zajistí promrznutí té masy vody kolem larvy.
Ledové krystaly tak proniknou do těla larvy. To pak znamená, že nejprve promrzá volná mezibuněčná tělní tekutina a díky rozdílům tlaků se současně odsává voda z buněk. Buňky tedy ztrácí obsah vody, smršťují se a zůstává v nich silně zahuštěný roztok s vysokou koncentrací prolinu. Prolin brání tomu, aby se zbylá voda uvnitř buněk připojila k ledovým krystalům.
Vše dochází až do fáze, kdy se za velmi nízkých teplot přemění zbylá voda uvnitř buněk do amorfního stavu, tedy do nekrystalické struktury. Buňky se proto výrazně nepoškodí. Vědce také zajímala otázka, zde je možné tyto jednoduché principy uplatnit také na organismus, který nikdy ve studených oblastech nežil, a je proto k chladu velmi citlivý. Vybrali si k tomu příbuznou mušku octomilku, která je původem z tropů. Larva tudíž nemá žádnou schopnost vstoupit do diapauzy, přesněji řečeno: na ledu za několik minut umírá.
Doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc., fyziolog hmyzu, Biologické centrum AV ČR: Výběr octomilky je nabíledni, protože je to velmi běžný a velmi používaný model soudobé biologie a víme o něm strašně moc a víme o něm, že nedokáže přežít za nízkých teplot.
Vědci larvy octomilky na nízké teploty přivykali postupně, a tak zastavili jejich vývoj, aniž by organizmus poškodili. Pak do larev v umělé výživě vpravili prolin, jehož funkci objevili. Souběh aklimatizace a prolinu umožnil larvám přežít zmrznutí tělních tekutin. Tak se jim jako prvním podařilo přeměnit tropického živočicha na živočicha tolerujícího zmrznutí. Dokáže však úspěšný výzkum na hmyzu přispět k vývoji technologií prospěšných pro člověka? V současné době se běžně využívá zmrazování lidských buněk pro transplantace kostní dřeně a pro uchovávání spermatu či raných embryí.
Prof. MUDr. Václav Mandys, CSc., přednosta Ústavu patologie 3. LF UK: Ten princip spočívá v tom, že se musí třeba buňky připravit v příslušném kultivačním médiu, potom se přidá k tomuto kultivačnímu médiu kryoprotektivum, což je chemikálie, která znemožní krystalizaci vody v buňkách během zmrazování, a potom následně je možné pomalu buňky zmrazovat.
I přes tyto úspěchy se zatím příliš nedaří postoupit na úroveň tkání, natož celých organizmů.
Doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc., fyziolog hmyzu, Biologické centrum AV ČR: Je možné, že některá z částí toho našeho výzkumu, která se týká primárně hmyzu, bude přenositelná i do výzkumu medicínského.
Schopnosti muších larev jsoujako sen. Bude ale jednou člověk schopen přijmout do svého těla látku, která by mu dovolila doslova "promrznout až na kost"?
Autor: Jan Oraský