Skrytá tvář (s)tvoření
18. 6. 2008
Pozorovat dnes takové detailní struktury, jako je například stavba chromozomů, již není díky světelné mikroskopii žádnou výjimečnou událostí. To, co se však dlouho nedařilo a zároveň tedy patřilo do oblasti snů a fantazie mnoha badatelů, byla možnost vidět pozorovaný objekt prostorově, aniž byl poškozen jeho dosud nutnou fyzickou přípravou, jako je příprava řezů a fixace. V České republice má tuto možnost zatím jediné pracoviště: Biologický ústav Lékařské fakulty v Plzni, které pro tyto účely vlastní laserový konfokální mikroskop FluoView. Díky němu zde pod vedením Doc. RNDr. Josefa Reischiga vznikají nejen zajímavé vědecké objevy, ale také nový druh biologického umění.
Doc. RNDr. Josef Reischig, CSc., Ústav biologie LF UK Plzeň: Biologický vědecký cíle spočívají vždycky v tom, objevit nějakou zvláštní, zajímavou vlastnost živých organizmů. A hlavně, proč organizmus reaguje na okolí a jak se dá ta vlastnost, třeba i geneticky podmíněná, nebo nepodmíněná, jak se dá ovlivnit.
Biologické vědy, které zkoumají přírodu, stále přinášejí nové objevy. Ty mohou sloužit k úspěšnější léčbě nemocných. Nové poznatky je ale také možné použít k tomu, že se člověk bude cítit na naší planetě dobře. Aby však dnes vědci mohli biologii pro všechny tyto záměry uplatnit, zdaleka už nevystačí s klasickými mikroskopy. Příprava vzorků pro pozorování totiž vyžaduje úpravy, které je mohou deformovat. Pak ovšem to, co je vidět pod mikroskopem, není možné považovat za zcela reálný obraz, ale pouze za jeho náznak. Výsledky jsou pak pochopitelně zkreslené.
Doc. RNDr. Josef Reischig, Ústav biologie LF UK Plzeň: Fluorescenční mikroskop bohužel detekuje všechny ty paprsky najednou, které jdou do objektu, takže se díváte na určitý objekt, třeba buněčné jádro, tak to máte jako kouli, která září, ale vy ji vidíte najednou a nemůžete proostřit dovnitř té koule. A to je velká nevýhoda.
Tým docenta Reischiga z plzeňského Biologického ústavu má naštěstí mikroskop, který tyto nedostatky dokáže odstranit. Je to jediný typ svého druhu v České republice – laserový konfokální mikroskop, který kromě klasické mikroskopie dokáže i spektrální analýzu, tedy zobrazit zkoumaný objekt v celém jeho rozsahu. Zdroj světla představuje soustava laserů. Ty pokrývají většinu takového spektra, které biolog potřebuje. Laserové paprsky řízené speciálním programem pak procházejí do vlastního mikroskopu.
Doc. RNDr. Josef Reischig, Ústav biologie LF UK Plzeň: To je ovládací panel. Zaostřuji, dávám tam různé intenzity laseru, prostě celé ovládání, osvětlení i jako přeostřování a všechno ostatní. Takže tady tím ovládám celou funkci mikroskopu, kromě posouvání preparátu v horizontální rovině.
Konfokální laserový mikroskop rozčlení celou strukturu sledovaného předmětu na optické řezy o velikosti dvou desetin mikrometru. Řezy je pak zase možné sestavit do trojrozměrného obrazu a vytvořit v podstatě originál – v tomto případě korýše.
Doc. RNDr. Josef Reischig, Ústav biologie LF UK Plzeň: Protože korýši vykazují určitou autofluorescenci v několika emisních délkách, tak je vlastně možnost se na toho korýše podívat očima ryby, protože my je vidíme jako průsvitný, kdežto ryba má schopnost je vidět jako fluoreskující organizmy, a ty jí vlastně svítí v temný vodě.
Většina vzorků ovšem schopnost autofluorescence nemá, proto je nutné preparáty speciálně připravit. Nemusí se sice rozřezávat ani fixovat, je však důležité vytvořit takové podmínky, aby se daly sledovat jako za živa.
V našem případě buňky sedí na speciálním sklíčku. A sklíčko se stane dnem zvláštní mikroskopické komůrky, která se využije k tomu, aby vědci mohli v konfokálním mikroskopu pozorovat živé buňky. A protože jsou různé vnitřní struktury buňky nabarveny zeleně, červeně nebo modře, je možné celý systém dlouhodobě sledovat v čase i v různých osách.
Tady u toho vzorku se hodnotí jakost mitochondrií, to znamená jejich funkčnost. Mitochondrie jsou buněčné organely, které buňku zásobují energií. A toto je speciální fluorescenční barvička, která umožní odlišit mitochondrie méně aktivní od více aktivních. Mitochondrie patří k nejmenším sledovaným objektům živé přírody. Jsou nesmírně citlivé na různé patologické stavy, jako je nedostatek kyslíku v tkáních.
MUDr. Lucie Hájková, odborná asistentka, Ústav biologie LF UK Plzeň: To se týká třeba takových stavů jako infarkt myokardu nebo v situacích, kdy jsou transplantovány orgány, kdy tkáně nejsou po nějaký čas dostatečně zásobovány kyslíkem. Čili tohle je způsob, kterým lze monitorovat stav buňky a tkáně, ale také pro nás je možnost potencionálně sledovat, zda takový nepříznivý stav, třeba nadbytečného nebo nedostatečného okysličení, je možné příznivě ovlivnit.
Laserový konfokální mikroskop využívá mnoho výzkumníků, ale tato pozorování mohou nakonec prospět každému z nás. Na základě monitorování buněk a tkání je totiž možné určit nepříznivý stav celého lidského organizmu.
Doc. RNDr. Pavel Fiala, CSc., Ústav anatomie LF UK , Plzeň: Hodnotíme třeba povrchy kostí, díváme se, jaké mají kosti cévní kanály, kam vstupují, jednak jsou to třeba speciálně upravené, vybroušené povrchy kostí, kanálky obsahující cévy které ukazují, jakým způsobem probíhají cévy na povrchu kosti. Lze tak zpětně odvodit způsob namáhání dlouhých kostí, což má význam pro ortopedy, pro traumatology …
Výhody laserového konfokálního mikroskopu jsou velké – zobrazuje struktury v hloubce vzorku, aniž by se vzorek musel upravit. Poskytuje možnost vytvořit prostorové představy o tkáni, umožňuje kvalitní barevné zobrazení. Toho všeho využívá také patofyziologie.
Doc. MUDr. František Vožeh, CSc., Ústav patologické fyziologie LF UK Plzeň: My máme k dispozici zvířata, která trpí neurodegenerací mozečku, což je model podobných onemocnění u člověka a my zkoumáme, jak se ta zvířata chovají a jakým způsobem lze toto onemocnění ovlivnit. No a k tomu potřebujeme dokument. To znamená my potřebujeme ukázat na našich obrázcích, jak vypadá mozek zdravého zvířete, jak vypadá mozeček nemocného zvířete, a jak vypadá v různých stadiích tohoto onemocnění.
Raritou využití mikroskopu je výzkum chorob starověkých civilizací. Probíhá na ústavu histologie a embryologie.
RNDr. Alena Němečková, CSc., Ústav histologie a embryologie LF UK Plzeň: Vyšetřují se zde vzorky jak klasickou histologií, to jsou měkké tkáně, dále kostní materiál, převážně kostní nádory maligní i benigní, a tyto nádory při vyšetření jsou velice náročné, protože se drobí a lámou, a proto nám velice pomáhá laser konfokální mikroskopie.
Normálním mikroskopem musíte dělat výbrus, což se vzorek ničí.
Doc. RNDr. Josef Reischig, Ústav biologie LF UK Plzeň: Takhle to vypadá v celku, řez tou kostí. A tady vidíte porušení kosti, porušení vzniklé třeba po rakovině kostí.
Prostřednictvím mikroskopu dokázal docent Reischig spojit výzkum s čistým uměním. A prý se nejedná o nic složitého. Zatímco malíř vytváří krásu ze své fantazie, v přírodě už krása sama od sebe je. Stačí ji pouze zaznamenat.
Doc. RNDr. Josef Reischig, Ústav biologie LF UK Plzeň: Spojovat krásu mikrosvěta s krásou makrosvěta, to se skoro dá porovnávat. Makrosvět my známe, mikrosvět vidíme v mikroskopu, a když se někdo podívá na ty detaily přírody přes mikroskop, tak vlastně zjistí, že zřejmě tvůrce byl jenom jeden, protože obojí do sebe zapadá. Proto se nám ty živý věci v mikroskopu jeví jako nádherný …
Doc. RNDr. Josef Reischig, Ústav biologie LF UK Plzeň: Ty fotografie, který se dělají z mikroskopu, ty mají vždycky obrovský ohlas, protože jich bývá málo. Málokdy k vidění, včetně krystalů cholesterolu. Nějaká paní říkala, že má zvýšený cholesterol, že jí to nevadí, když jsou ty krystaly tak nádherný.
Laserový konfokální mikroskop přispěl k mnoha novým biologickým poznatkům. Pohled na živý organizmus se proto velmi liší od pohledu před padesáti, sto lety. Přesto v učebnicích biologie zastaralé teorie přetrvávají dodnes.
Doc. RNDr. Josef Reischig, Ústav biologie LF UK Plzeň: Pořád existují teorie, které se učí na střední škole, že z nějakého koacervátu vznikne jiný koacervát a z toho vznikne živá buňka, takový ty Oparinovy teorie a tyhle věci, to si myslím, že už není na místě, aby to vůbec někdo řekl, natož napsal do učebnic.
Autor: Vít Hájek